Come tutte le grandi scoperte, anche quella del ciclo di Krebs non nasce dal nulla ma da una solida tradizione di investigazioni biochimiche; e non nasce matura ma in una forma ancora incompleta e suscettibile di perfezionamenti e chiarimenti. La pubblicazione ritenuta in genere fondamentale porta il titolo "The role of citric acid in intermediate metabolism in animal tissues" di H.A. Krebs e W.A. Johnson. Il manoscritto, rifiutato da Nature, apparve nel 1937 sulla rivista Enzymologia di Amsterdam (vol. 4, pp. 148-156); oggi questa rivista ha cambiato nome ed e' diventata Cellular and Molecular Biochemistry (edita da Springer). La rivista e' disponibile (tra l'altro) presso la biblioteca centrale del CNR, in Piazzale Aldo Moro 7, Roma, sotto la collocazione QP601.
Nell'Introduzione e nella discussione Krebs e Johnson riportano un breve elenco degli intermedi noti della degradazione ossidativa del glucosio: gli acidi succinico, fumarico e ossalacetico scoperti da Szent-Gyorgyi, l'acido isocitrico (Wagner Jauregg e Rauen), il cis-aconitico, l'alfa chetoglutarico, il malico: quasi tutti gli intermedi erano gia' stati identificati ma l'ordine della loro apparizione e scomparsa ed il loro ruolo erano oscuri.
Effetto del citrato sulla respirazione del muscolo pettorale di piccione triturato (esperimento manometrico).
Krebs e Johnson osservano che l'aumento del consumo di ossigeno causato dal citrato e' ancora maggiore in presenza degli altri substrati quali glucosio o glicogeno o glicerofosfato, e che un effetto catalitico simile e' esercitato da fumarato, ossaloacetato e succinato. Le conclusioni che gli autori traggono da questi dati sono tre: 1) la sostanza ossidata nel muscolo deriva da un glicide, probabilmente un trioso); 2) un metabolita che puo' essere prodotto a partire da uno qualsiasi tra citrato, fumarato, ossaloacetato e succinato e' richiesto come catalizzatore; 3) il citrato deve essere costantemente consumato e rigenerato, e l'obbiettivo successivo e' quello di chiarire le reazioni nelle quali questo avviene.
Per individuare i metaboliti del citrato, Krebs e Johnson hanno a disposizione alcuni inibitori, e dimostrano che in presenza di arsenito la respirazione e' inibita e si accumula l'acido alfa chetoglutarico; questo conferma un risultato precedente di Martius e Knoop. La resa dell'alfa chetoglutarato (misurato mediante conversione in succinato) e' circa il 90% rispetto al citrato (misurato colorimetricamente).
acido citrico -> acido alfa chetoglutarico -> acido succinico -> acido fumarico -> acido l-malico -> acido ossalacetico
Krebs e Johnson considerano anche due metaboliti ulteriori noti dell'acido ossalacetico: l'acido piruvico e l'acido acetico, e dimostrano che questi mancano dell'azione catalitica sul consumo di ossigeno posseduta dall'acido citrico e da tutti i suoi metaboliti fino all'ossalacetico. Dunque gli acidi piruvico e acetico non sono in grado di rigenerare l'acido citrico e non appartengono a questa via metabolica.
Il lavoro di Krebs e Johnson e' particolarmente notevole per l'ingegnosita' degli esperimenti e per l'abilita' dell'interpretazione. Il primo risultato che gli autori riferiscono e' che il citrato ha un effetto catalitico sulla respirazione del muscolo striato: l'aggiunta di citrato al tessuto fresco triturato causa un aumento del consumo di ossigeno superiore a quello necessario ad ossidare il citrato aggiunto. Questo risultato e' riassunto nella prima tabella che e' concepita in questo modo:
microlitri di ossigeno assorbiti da 460 mg di muscolo (peso umido) sospesi in 3 ml di PBS
Tempo (min.) Nessun substrato aggiunto 0,15 ml di citrato 0,02M 30 645 682 60 1055 1520 90 1132 1938 150 1187 2080
L'aumento di consumo di ossigeno (893 microlitri dopo 150 min.) e' pari a circa il triplo dell'ossigeno necessario ad ossidare il citrato aggiunto (302 microlitri).
Il malonato e' un altro inibitore della respirazione e Krebs e Johnsono dimostrano che questa sostanza causa accumulo di acido succinico (misurato col metodo manometrico di Szent-Gyorgyi). Poiche' la respirazione produce CO2, gli intermedi metabolici contenenti un minor numero di atomi di carbonio sono successivi a quelli che ne contengono un maggior numero e pertanto l'acido succinico rappresenta uno stadio del percorso metabolico successivo a quello dell'alfa chetoglutarico. Mettendo insieme questi dati e quelli riportati nell'introduzione, gli autori sono in grado di proporre la seguente sequenza di intermedi, ordinati per numero di atomi di carbonio, stato di ossidazione e in alcuni casi grazie all'esperimento diretto con enzimi purificati:
Ci sono altri metaboliti? Krebs e Johnsono considerano gli acidi isocitrico, cis-aconitico e l'instabile ossalosuccinico che decarbossila spontaneamente ad alfa-chetoglutarico, suggeriti da altri autori; questi sono evidentemente intermedi tra citrico e alfa-chetoglutarico.
In che modo l'acido ossalacetico, l'ultimo metabolita che ancora puo' esecitare azione catalitica sulla respirazione rigenera l'acido citrico? E' evidente che deve esistere un composto carbonioso, che sara' trasformato in CO2, capace di combinarsi con l'acido ossalacetico per formare l'acido citrico. Krebs e Johnson non sono in grado di identificarlo con precisione, ma sanno che il citrato catalizza l'ossidazione degli zuccheri fino ai triosi e quindi indicano questa sostanza come un "trioso", senza poterne specificare il nome e la formula.